填精助阳药对“肾阳虚”动物模型肾脏AKP、SDH活性的作用

马正立、施玉华

（2000－11－1）

肾的理论是中医脏腑学说的重要组成部分。现代医学研究证明，肾与下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴及免疫功能、生殖功能有着密切的联系，因而应用过量的肾上腺皮质激素，可导致大（小）白鼠等实验动物出现耗竭现象，而摸拟出阳虚证的动物模型。本实验选用此模型，并观察服用助阳药后对该模型肾脏碱性磷酸酶（AKP）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的作用。

AKP在碱性环境该酶催化各种醇和酚的磷酸酯水解，存在于活跃运输的膜上，如毛细血管及毛细血管的动脉部分的内皮，肾近曲小管壁边缘和小肠上皮的纹状缘含量最为丰富。它与骨质的形成，维持细胞内磷酸酶的浓度，以及与经膜吸收和转运过程有关。

SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，它和线粒体的内膜牢固结合。在心肌细胞、肾的近端和远端小管细胞以及肝细胞都有高度活性的琥珀酸脱氢酶。是组织化学中最常用酶之一，是不依赖辅酶的酶，它催化三羧酸循环中琥珀酸与延胡索酸之间的反应，故组织化学中常用来反映三羧反应的情况而作为标志酶。

一、原理

1．AKP的组织化学显示法有：

（1）金属沉淀法，又称钙钴法。此法的基本原理是在酶活动的位置形成磷酸钙的沉淀。组织切片孵育在有激活剂（Mg++）和pH9.4的缓冲液中，底物（β-甘油磷酸钠），被水解的甘油钠和磷酸，释放出来的磷酸被高浓度的钙盐所捕获，在酶活动处形成磷酸钙，磷酸钙在碱性pH环境下是完全不溶的，但是是不可见的，经过两次置换，磷酸钙经硝酸钴变为不溶的磷酸钴，经硫化铵作用而成为黑色的硫化钴沉淀。由于钙钴法需经多次转换，容易发生物质的转移和弥散。为减少弥散，有用未经脱蜡的切片，经作用后再脱蜡封片；或者应用冰冻干燥法，和固定后的冰冻切片较好。

（2）偶联偶氮法。此法的基本原理为底物（磷酸萘酯）为酶水解释放出萘酚，立即为重氮盐所捕获而成为不溶性有色的偶氮染料。实验最初（1944）应用β-萘磷酸盐作为底物，释放出的萘酚与重氮α-萘胺偶联，在酶的活动处形成有色沉淀。Burstone 1962推荐用替代萘酚，如萘酚AS-MX磷酸盐。重氮盐有很多种，但较适宜的有Fast blue RR, Fast red TR, Fast violet B, Fast blue VRT 和Fast black B。偶联偶氮法与钙钴法比较，前者孵育时间短；方法比较稳定，灵敏；在正常组织中因无萘酚，故不需要对照片；反应产物为偶氮染料比磷酸钙更难溶解，不易弥散因而图象清晰。

2．SDH的组织化学显示原理：

脱氢酶是从底物将氢传递给受氢体的酶系，它不同于氧化酶的是不能以氧分子作为受氢体而只能以体内某些辅酶作为受氢体。这些辅酶包括辅酶I（NAO），辅酶II（NAOP），或黄素蛋白，然后经氢传递系统使受氢体还原显色，从而达到定位目的。

组织化学显示脱氢酶的方法，可区分为不依赖辅酶和依赖辅酶二种。在脱氢酶的反应中，除四唑盐外，所有因子（包括底物），可能就是参与体内反应的因子。

四唑盐在反应中作为受氢体，由脱氢酶将底物的氢原子转移到四唑盐而形成有色的Formazan，后者在酶活性处沉淀，即可显示酶的定位。同时四唑盐是水溶性物质，具淡黄色或竭色，当被氢作用而还原时，即变为难溶于水，以至不溶于水的蓝色或蓝紫色的Formazan。琥珀酸脱氢酶最适宜的pH为7.6，琥珀酸脱氢酶对固定剂十分敏感。大鼠的各器官、组织盐只能耐受冷甲醛的固定5-15分，而戊二醛则完全抑制酶的活性。

二、实验准备

1．器材

恒冷箱切片机及附件

镊子

固定缸

37℃培养箱

定时器

酒精灯

2．试剂

甘油明胶

冷丙酮

甲醛钙液

甲绿（氯仿洗过）。

蒸馏水

盐水

80%乙醇

Gomori 钙钴法显示AKP溶液（Gomori,1952;Butcherchayen,1966）

2%巴比妥钠5ml

3%β-甘油磷酸钠5ml

2%无水氯化钙（或2.7%CaCl2.2H2O）10ml

5%硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5ml

蒸馏水2.5ml

溶液的最终pH调至9.4

偶联偶氮法显示AKP溶液（BursTone法，1962）

萘酚AS-MX磷酸盐10mg（溶解于）

二甲基甲酰胺（DMF）0.25ml

蒸馏水25ml

0.2 mol Tris缓冲液（pH8.4-8.6）25ml

使用之前加重氮盐Fast red violet LB 或Fast red TR 30mg并过滤。

琥珀酸脱氢酶作用液（Pearson，1958）

0.1mol琥珀酸钠5ml

0.1mol磷酸缓冲液(pH7.6)5ml

NBT10mg

二甲基亚砜（DMSO）5ml

NBT先溶于DMSO中，然后加入琥珀酸钠及磷酸缓冲液中。

3．实验材料

实验动物：正常对照组，模型组，模型加中药组等3组

载玻片、盖玻片

三、实验步骤

1．取材及处理：实验动物采用颈椎脱位法或断头法处死，尽快取出肾。根据实验的要求可以采集不同的脏器样品，每种样品可取2块：一块用于普通组织学标本制备，用Cannoy氏液固定、梯度乙醇逐级脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片机切片、苏木素伊红染色、普通光镜观察；一块用于组织化学的标本制备，液氮或干冰骤冷、低温恒冷箱切片机切片、组化反应、普通光镜观察。本实验介绍后者。

2．Gomori钙钴法显示碱性磷酸酶

（1）新鲜组织恒冷箱切片8μm。

（2）不经过固定，直接进入作用液，或者经过适当的固定之后，将切片经蒸馏水冲洗，然后进入作用液。

（3）孵育10-60分钟，37℃根据组织而定，如肾脏为10分钟，肝脏为60分钟。

（4）流水冲洗5分钟。

（5）2%硝酸钴溶液5分钟。

（6）蒸馏水轻洗。

（7）浸入1-2%硫化铵1分钟。

（8）蒸馏水冲洗。

（9）甘油明胶封固。

3．偶联偶氮法显示碱性磷酸酶

（1）新鲜组织恒冷箱切片8μm，并固定于冷丙酮内5分钟；或组织固定在甲醛钙液3-4小时，0℃，然后用恒冷箱切片。

（2）切片入作用液孵育15分钟至2小时，37℃或室温。

（3）蒸馏水洗5分钟。

（4）1%甲绿复染（氯仿洗过的甲绿）。

（5）蒸馏水洗5分钟。

（6）甘油明胶封固。

4．琥珀酸脱氢酶

（1）新鲜组织恒冷箱切片8μm，孵育15-35分钟，25℃（心肌15分钟，肾20分钟，肝30分钟）。

（2）盐水洗。

（3）甲醛钙固定10分钟。

（4）80%乙醇 5分钟。

（5）甘油明胶封固。

四、实验结果

用显微镜100倍和400倍观察以上染片，注意各组之间的差异：

1．Gomori 钙钴法显示碱性磷酸酶：碱性磷酸酶活动处有棕黑色的COS沉淀，3个组别强度有所不同。

2．偶联偶氮法显示碱性磷酸酶：酶活动力处为红色偶氮染料沉淀。核染绿蓝色，对比度鲜明。3个组别强度有所不同。

3．琥珀酸脱氢酶：酶活性处表现为蓝紫色沉淀。3个组别强度有所不同。

五、注意事项

1．实验动物处死后，应尽快取出组织，处理。不然动物死后，组织会迅速发生变化，例如胸腺ATP含量、肝糖原可在死亡后5-10分内降低50%及40%。除迅速处理外，低温处置可降低组织中水解酶的作用，从而减少组织成分发生变化。

2．为避免染色误差，要求把3个组别的组织（各取1-2块）放在同一软木垫上冰冻，切片，以保证染色条件一致。

参考文献

1．武内忠男、小川和朗主编，朱逢春主译.新酶组织化学.人民卫生出版社.1983.

2．陈啸梅.组织化学手册.人民卫生出版社.1982.