填精补肾中药对老龄大鼠性腺3β-HSD和20α-HSD活性的作用

马正立、施玉华

（2000-11-1）

随着机体的生长、发育和衰老，体内各器官、系统都将不同程度地发生变化，这些变化有的是功能性的，有的是器质性的。中医基础理论认为衰老取决于肾气的盛衰。《内经》曾描述道，随着年龄的增长，肾气会由盛而转衰，其标志之一是生殖能力的强弱。据此本实验观察填精补肾中药对老年大鼠性腺的作用。从模型角度而言，老年性肾虚动物模型较之用药物所致的病理性模型具有形成自然，病理变化与临床较为符合等优点。

3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）是Wattenberg 1958年建立第一个用组织化学方法检测与类固醇有关的脱氢酶。多数以类固醇为底物的脱氢酶不仅见于分泌类固醇的脏器，而且在肾、肝、小肠等组织的分布亦被研究。3β-羟基类固醇脱氢酶参与类固醇的合成，且和细胞的生理活动有关。睾丸、卵巢和胎盘都含有丰富的酶。子宫内膜的酶活性亦较强。睾丸的间质细胞，卵巢的泡膜细胞以及肾上腺皮质的网状带也都富于酶的活性，且与动情周期的时相有关。

20α-羟基类固醇脱氢酶（20α-HSD）为NADP依赖性酶，此酶不存在于卵巢以外的组织，而且只存在于月经期黄体中，妊娠的黄体和胎盘是缺乏的，特别在妊娠的最后一周，其他组织包括内分泌腺、肝与肾均为阴性，酶反应强度亦与性周期有关。此酶对20α-羟基构型有绝对的专一性，在碱性pH时有利20α-孕-4-烯-3-酮氧化为孕酮，故推荐用此法作为观察孕酮的代谢水平。

一、原理

3β-HSDH和20α-HSD组织化学显色原理与实验7．5的SDH显色原理类似。

二、实验准备

1．器材

恒冷箱切片机及附件

镊子

-20℃冰箱

固定缸

37℃培养箱

定时器

酒精灯

2．试剂

10%福尔马林含50%乙醇混合物

10%的福尔马林

甘油明胶

冷丙酮

甲醛钙液

甲绿（氯仿洗过）。

蒸馏水

生理盐水

80%乙醇

3β-HSDH反应溶液

脱氢表雄酮（DHEA）10mmol溶于丙酮0.5ml

尼克酰胺 (1.6mg/ml)1.0ml

硝基蓝四唑（NBT）(1.0mg/ml)1.5ml

辅酶I（NAD）(3.0mg/ml)1.2ml

磷酸缓冲液0.1mol, pH7.1-7.45.8ml

20α-HSDH作用液

硝基蓝四唑（NBT）5mg

辅酶II（NADP）5mg

乙二胺四乙酸（EDTA）10mg，溶解于Tris缓冲液(pH8.0)10ml

50%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）溶解于Tris缓冲液（pH8.0）2ml

最后加入含有20α-羟孕-4-烯-3-酮（mp165-166[α]。104o）二甲基甲酰胺 1ml

（当底物加入时会发生云絮状，但对反应无碍。）

3．实验材料

实验动物：雌性Wistar大鼠。

中药：仙茅、淫羊藿、巴戟天。按常规水煎剂制备。

载玻片、盖玻片。

三、实验步骤

1．大鼠由13月龄起饲养观察至20月龄。饲养期间除按正常饲养条件喂养外，注意饲养室温度、湿度变化。以及动物进食、饮水及体重增长情况。动物随机分为老年组和中药组两组，中药组每日饲喂中药水煎剂（剂量相当于成人公斤体重的20倍）。老年组每日喂相当量的自来水；中药组每周喂药五天，停药二天。在实验的最后二周增加相对等的青年对照组。老年动物模型外形表现为体态臃肿，行动迟缓，少动，反应迟钝，体毛粗刚，无光泽，泛黄，后期进食及饮水量减少，并时会发生肿瘤。老年动物模型属肾精亏虚证。

2．取材及处理。实验动物用断头法大鼠处死。迅速取同侧的卵巢作组织化学反应。

3． 3β-羟基类固醇脱氢酶反应

（1）新鲜组织恒冷箱切片，厚10μm。

（2）切片在冷丙酮脱脂，30分钟（-20℃）。

（3）孵育在作用液内20分钟，37℃。

（4）蒸馏水洗。

（5）固定在10%福尔马林含50%乙醇混合液内30分钟。

（6）蒸馏水洗5分钟。

（7）甘油明胶封固。

4．20α-羟基类固醇脱氢酶反应

（1）新鲜组织恒冷箱切片，厚10μm。

（2）切片在室温干燥。

（3）作用液孵育20分钟，37℃。

（4）固定在10%的福尔马林，1小时。

（5）生理盐水短暂冲洗。

（6）甘油明胶封固。

四、实验结果

用显微镜100倍和400倍观察以上染片，注意各组之间的差异：

1．3β-羟基类固醇脱氢酶：酶活性处有紫蓝到蓝色的Formazan颗粒沉淀。3个组别反应范围及强度不同。

2．20α-羟基类固醇脱氢酶：酶活性处有紫蓝到蓝色的Formazan颗粒沉淀。3个组别反应范围及强度不同。

五、注意事项

1．实验动物处死后，应尽快取出组织，处理。

2．为避免染色误差，要求把3个组别的组织（各取1-2块）放在同一软木垫上冰冻，切片，以保证染色条件一致。

3．如果计划观察间脑、垂体，要求迅速取出垂体，固定于甲醛汞溶液，按常规方法制成石蜡切片，厚4μm。切片需从垂体边缘沿冠状面作连续切片，并记录每一切面的编号。切片用Herlant’s阿利新蓝（pH0.2）染色，然后用高倍镜或油镜观察垂体前叶细胞。间脑固定于Bouin氏液，石蜡包埋，额状连续切片，厚10μm ，醛复红染色显示神经分泌颗粒。选择核团大的切片，统计同一切面左、右视上核、旁室核的细胞数。

参考文献

1．武内忠男、小川和朗主编，朱逢春主译.新酶组织化学.人民卫生出版社.1983.

2．陈啸梅.组织化学手册.人民卫生出版社.1982.