用溶血空斑试验观察中药对抗体形成细胞的影响

章育正

（2000－11－1）

本试验在体外检测抗体形成细胞（B细胞）的数量和功能，常用于检测中药（或其他药物）对实验动物体液免疫功能的影响。本试验具有特异性高、方法不甚复杂、直接可以观察到结果等优点。通常应用直接法，此法仅用于测定B细胞产生的IgM的高低。

一、原理

将经过绵羊红细胞（SRBC）免疫后的小白鼠的脾脏淋巴细胞，在体外与SRBC一起混入适当浓度的琼脂糖内，于37℃孵育一定时，待淋巴细胞释放溶血素（抗SRBC抗体），在补体参与下，即能使SRBC溶解，从而在每一淋巴细胞周周围形成一个肉眼可见的溶血空斑，空斑数多少代表免疫力的强弱。

二、实验准备

1．器材

培养箱

离心机

细胞计数器

计数板

显微镜

剪刀、镊子

注射器

尼龙网

盖玻片、载玻片

毛细吸管

小平皿

搪瓷盘

解剖板

试管

平皿

2．试剂

琼脂糖

补体（新鲜豚鼠血清）

RPMI—1640营养液（含胎牛血清）

0.1mol/L台盼兰染液（pH7.2）

3．实验材料

动物：小白鼠（体重18—22克）10只。其中5只用作空白对照，另5只饲以生晒参水煎液（剂量为成人公斤体重的20倍）5天。

三、实验步骤

1．绵羊红细胞悬液制备。以无菌操作抽取绵羊血，保存于保存液中，置4℃冰箱中，一般不超过2周。实验时取出，用生理盐水洗涤三次，每次2000转/分离心5分钟，然后配成每毫升含2×109（20亿个/ml）和10%（2.5×109/ml）红细胞备用。

2．免疫动物及脾细胞悬液的制备。取2×109/ml的SRBC悬液给每只小鼠腹腔中注射0.5ml（1×109/ml细胞），免疫后第四天，经颈动脉放血处死，摘取脾脏，将脾脏置含有营养液的清洁小玻皿内，在尼龙网上用注射器芯子压碎，吹打均匀，静置5分钟，待粗渣下沉后，吸取上层均匀细胞悬液作白细胞计数及台盼兰染色以检查细胞存活率，要求细胞存活率>90%，然后用含10%胎牛血清（Fcs）的1640液稀释成1×107/ml脾细胞。

3．溶血空斑测定。取小试管若干，置45℃―48℃恒温水浴中，每管加入融化的0.5%琼脂糖0.25ml，置45℃水浴中保温，再依次加入1×107/ml免疫鼠脾细胞0.1ml(对照鼠组加同量正常小鼠脾细胞)，1∶10稀释的新鲜豚鼠补体0.1ml及10%SBRC 0.05ml，迅速混合，准确吸取0.1ml滴于干净玻片上，随即盖上24×32mm盖玻片一块，使细胞悬液均匀摊开，移置湿盒中，放37℃，2小时后观察结果。

四、实验结果

计数每张玻片上的小而透明的空斑，即为B细胞释放的抗体（溶血素），在补体参与下将SRBC溶解后产生的空斑。计算每张玻片上的空斑数后，再换算成每百万细胞中的空斑数，亦即抗体形成细胞数。比较用药小鼠与空白对照小鼠的区别。

五、注意事项

1．试验前的脾细胞必需冰浴放置，以保持其活力。

2．试验时，如天气寒冷，所用试管、玻片均需预热，以防注入琼脂糖凝固。

3．操作时必需保温在45℃，混合液滴于玻片上后，迅速盖上玻片，以免琼脂摊开得不匀因出现凝固而影响计数。

参考文献

1．林云璐. 免疫学基本技术. 上海医科大学. 1990.

2．毕爱华. 医学免疫学. 人民军医出版社. 1995.

3．龙振洲. 医学免疫学. 人民卫生出版社. 1996.