川芎嗪对平滑肌细胞增生相关基因表达的影响

姚明忠

（2000－11－1）

一、原理

经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)以其无需开胸而获冠状动脉血运重建之效，成为阻塞性冠状动脉病变的主要治疗方法之一。但是，此手术后有30-40%的再狭窄发生率，从而限制了其临床应用和远期疗效。引起再狭窄形成的主要机理为球囊损伤后，血管平滑肌细胞（VSMC）向内膜迁移、增生、泡沫样变，形成粥样斑块，造成管腔狭窄与阻塞。针对几种VSMC增生相关生长因子的基因表达进行研究，有助于阐明VSMC增生的原理。川芎嗪为常用活血化瘀中药川芎的主要有效成分，它可以抑制 PTCA 后家兔髂动脉内膜增生，防止再狭窄形成。史大卓等采用原位杂交技术，观察其对 PTCA后再狭窄部位VSMC增生相关基因表达的影响，以经一步阐明川芎嗪抑制VSMC增生的机理。本实验参考他们的报道。

二、实验准备

1．器材

超净工作台

CO 培养箱

倒置相差显微镜

无菌消毒滤器

培养瓶

培养板

手术器械

2．试剂

DMEM培养液

胎牛血清

川芎嗪注射液

地高辛dUTP标记试剂盒

碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)

内皮细胞衍生舒血管因子 (EDRF)

c-myc、 p53 cDNA探针

3．实验材料

正常家兔新鲜主动脉和再狭窄形成家兔腹主动脉中膜。

三、实验步骤

1．PTCA后家兔腹主动脉再狭窄模型的建立

新西兰家兔15只，雌雄不限，体重2.5-3kg, 5只作正常对照，10只家兔造模。造模家兔在X线透视下，经股浅动脉逆行插入4F Fogarty导管，至腹主动脉肾动脉分支部位，用1ml注射器注入0.5-0.8ml气体，反复缓慢抽拉3次，损伤腹主动脉、髂动脉内膜，术后喂饲含有2%胆固醇、10%花生油的混合饲料共6周，而后经右颈动脉插入4F Fogarty导管至腹主动脉肾动脉分支部位，动脉造影证实腹主动脉、髂动脉形成AS狭窄后，将球囊送至动脉狭窄部位，分别以4、5、6个大气压进行扩张，连续3次，每次持续30s，间隔1min。扩张术后即日，停高脂饲料，至PTCA后4周，处死家兔，分离出腹主动脉，进行中膜VSMC培养。

2．原代细胞培养

将正常家兔新鲜主动脉和再狭窄形成家兔的腹主动脉中膜剪成0.5mm×0.5mm大小的组织块，均匀铺于60ml的培养瓶中，加入含20%胎牛血清的EMDM培养液，5%CO2、37℃的条件下原代细胞培养。

3．传代培养

待细胞生长融合后，进行常规传代培养，传代培养液中含10%的胎牛血清，其他条件同原代细胞培养。培养细胞生长至第三代时，将其接种于装有载玻片的24孔细胞培养板内，待载玻片被覆盖90%左右时，更换不含胎牛血清的EMDM培养液24h，使细胞同步化，然后换成含5%胎牛血清的EMDM 培养液培养6-9h。培养细胞分为4组：正常组、再狭窄细胞组、川芎嗪大剂量组（10 -2mg/ml）、川芎嗪小剂量组（10-3 mg/ml）。

4．原位杂交

按地高辛标记试剂盒介绍方法，用地高辛- dUTP标记bFGF 、c-myc、 EDRF、p53 cDNA 探针。VSMC的原位杂交参照《现代分子生物学实验技术》介绍方法，进行细胞原位杂交。

四、实验结果

bFGF 、c-myc cDNA原位杂交发现：腹主动脉再狭窄形成部位VSMC 胞浆内满布此两种基因杂交信号，bFGF mRNA 阳性颗粒均匀分布于胞浆内，c-myc mRNA杂交信号以核周围更为明显，核内也可见到少量杂交信号。大剂量川芎嗪组再狭窄部位VSMC此两种基因的表达阳性颗粒明显少于未加药组，小剂量川芎嗪组再狭窄部位VSMC和再狭窄部位VSMC未加药组相比，也有减少，但其阳性信号表达却多于大剂量组。正常VSMC 胞浆内此两种基因的表达信号较少；EDRF、p53 cDNA VSMC原位杂交观察结果：正常家兔主动脉VSMC均有 EDRF mRNA、p53 mRNA 的丰富表达，杂交阳性颗粒呈棕褐色，再狭窄腹主动脉部位VSMC此两种基因杂交信号表达较少，再狭窄腹主动脉VSMC川芎嗪大剂量组，此两种基因杂交信号较再狭窄腹主动脉VSMC表达丰富，川芎嗪小剂量组此两种基因杂交信号的表达也较再狭窄腹主动脉VSMC有所增加。

五、注意事项

细胞原位杂交实验时均应设立无探针阴性对照组，无探针组仅见细胞本底颗粒，无杂交阳性信号，才能说明原位杂交具有特异性。

参考文献

史大卓，等. 川芎嗪对平滑肌细胞增生相关基因表达的影响.活血化瘀研究 . 中国医药科技出版社出版. 1995. 第一版.

赵三妹，等. 动脉平滑肌细胞的培养方法及其应用. 中华病理学杂志. 1987，16（4）：260~262.

卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 高等教育出版社. 1993. 第一版.