瘀毒阻滞证肝癌（含肝）组织N-ras基因转录水平的变化（一）

——异硫氰酸胍一步法制备不同肝组织的总RNA

方肇勤

（2000-11-1）

临床研究表明，瘀毒阻滞证是原发性肝癌的基本病机。肝癌的发生，往往建立在长期、反复的肝胆湿热基础上，反复的肝脏炎症损伤基础上，日久形成瘀毒阻滞病机。已有的研究表明，瘀毒阻滞证的肝组织中，部分与癌证发生有关的基因转录与表达的水平会发生异常。食入二乙基亚硝胺（DEN）会引起肝炎，长期食入会诱发大鼠肝癌，其病理演变与人类肝癌发生的病理相似。因此，本实验采用DEN诱发大鼠肝癌，分设模型组和正常对照组，模型组自由饮用DEN水溶液，浓度为80mg/L，造模24周后处死大鼠，分别切取出肝（模型组含肝癌）组织，用于制备RNA。

制备纯净且完整的RNA对于许多分子生物学实验至关重要。RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。RNA的制备方法有多种，本实验采用制备总RNA一步法。

一、原理

本方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍等，抑制RNA的降解，并使RNA与蛋白质分离进入溶液，离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，之后被异丙醇沉淀。提取的RNA可用于Northern blot和过Oligo dT柱。

二、实验准备

1．器材

实验台、剪刀、镊子

电子天平、称量膜

可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头

经消毒的1.5ml Eppendorf管、10ml离心管、试管架及其水浴用试管架

定时器、记号笔、一次性手套和筒纸

4℃、-20℃和－70℃冰箱

JB50-D型匀浆器（含玻璃匀浆管及杵）

冷冻1.4万转台式离心机

真空离心干燥器、真空泵

分光光度计、石英比色杯

双蒸水、冲洗瓶

2．试剂

Ｄ溶液：

异硫氰酸胍250 g

去离子水293 ml

0.75 mol 柠檬酸钠（pH 7）17.6 ml

10％十二烷基肌氨酸钠26.4 ml

以上为贮藏液，室温下可保存三个月。使用前加：

0.36 ml β－巯基乙醇→50 ml 上液，即为Ｄ溶液。

水饱和酚(4℃)

氯仿:异戊醇（49:1）

75％预冷乙醇

高压消毒过的去离子水

2M醋酸钠（pH 4）

异丙醇

3．实验材料

肝癌模型大鼠和正常同龄大鼠肝脏各一只

碎冰及其保温容器

三、实验步骤

布置实验环境，试管编号。

分别断头处死大鼠，剖腹切取各大鼠肝脏（含肝癌）组织，称取50 mg，冰上剪碎。

分别把剪碎的肝脏组织移入匀浆管，加入：

500 ulＤ溶液

室温下匀浆（9档，1分钟），把匀浆液移入1.5ml管，分别依次加入：

50 ul 2mol 醋酸钠（pH4）

500 ul 水饱和酚

100 ul 氯仿:异戊醇（49:1）

充分颠倒混匀 10 s.，置于冰上 15 min.；

离心10,000 g 20 min.于4℃，移上清入一新1.5ml管，加入：

500 ul 水饱和酚

100 ul 氯仿:异戊醇（49:1）

充分颠倒混匀 10 s.，置于冰上 15 min.；

离心10,000 g 20 min.于4℃，移上清入一新1.5ml管，加入：

500 ul 异丙醇(-20℃预冷)

颠倒混匀，-20℃放置 1 hour，离心10,000 g 20 min.于4℃，去水相，加入：

150 ul Ｄ溶液，指拨溶解沉淀，加入：

150 ul 异丙醇(-20℃预冷)

指拨混匀，-20℃放置1 hour，离心10,000 g 20 min.于4℃，去水相，加入：

500 ul75％乙醇(-4℃预冷)

离心10,000 g 10 min.于4℃，去乙醇，真空离心干燥 15 min.，加入：

25 ul 经高压消毒过的去离子水，于冰上溶解RNA。保存于－70℃冰箱。

紫外分光光度计测定RNA的含量：

取样本5ul加入石英比色杯内，加入双蒸水0.8ml，充分混匀。与双蒸水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算：

260nmOD为1时，为40ug RNA，因此计算如下：

260nmOD×160×40

样本RNA含量（ug/ul）=─────────

1000

当OD值260/280<1.8时，提示有蛋白或酚的污染。

四、实验结果

分光光度计读数 260/280 值约为 1.85±0.04。

五、注意事项

1．鉴于肝癌组织质地的不均匀性，或为纯癌肿，或为血肿，或以异常增生的肝组织为主，同一肝组织所取材的不同，其结果便会不同。因此，为避免取材上的误差，可以切取较大的肝组织，以便包含不同质地的肝组织，使各组的取样误差减到最小。

2．实际研究时，作为小样本，同一组通常要求10只以上大鼠，各取一块肝组织，以减少误差。由于肝组织量增多，所有试剂均须按比例放大。

3．由于RNA酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致RNA的降解，使整个工作功败垂成。因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明RNA专用。严格按无菌操作要求操作。抽提过程中，由于异硫氰酸胍是RNA酶的强抑制剂，因此在整个实验过程中不会产生RNA的降解。但在最后一步，RNA干燥和加水溶解时特别要防止RNA酶的污染。

4．在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染。因此，通常轻轻吸取上清，且留有部分上清，以免搅起紧邻着的酚。

5．若需抽提大量RNA时，以上试剂、试管可按比例放大。所获RNA建议分装，以免使用过程中污染、降解。

参考文献