瘀毒阻滞证肝癌（含肝）组织N-ras基因转录水平的变化（二）

——Northern Blot比较不同肝组织N-ras的转录水平

方肇勤

（2000－11－1）

本实验采用Northern blot 方法，对实验十七制备的RNA进行分析，观察瘀毒阻滞证肝（含肝癌）组织的N-ras基因转录量与正常肝组织的转录量是否存在差异。

一、原理

采用琼脂糖凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜上，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。采用放射性标记的探针与膜上的RNA杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素。放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量mRNA的自显影条带。比较条带的深浅，可以用激光扫描光密度仪定量，明确正常肝与瘀毒阻滞证肝组织N-ras基因转录量的多寡。

二、实验准备

1．器材

天平、秤量匙、秤量皿

加热磁力搅拌器、搅拌子

电源、水平电泳仪及其附件

可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头

经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架

定时器、记号笔、一次性手套和筒纸、滤纸

25毫升吸管、镊子、单面刀片、剪刀、直尺

台式4℃ Eppendorf管离心机

荡平式离心机

4℃和-20℃冰箱

37℃和65℃恒温水浴

玻璃容器或饭盒、若干块玻璃板

煤气灯、铝锅

250ml烧杯、100ml玻璃量筒、1000ml塑料量筒

离心真空干燥器

加热真空干燥箱（含真空泵、冷凝器）

盖革计数器

塑料封口仪、杂交用塑料袋、保鲜膜

可调（30-90℃）恒温水浴摇床

长波紫外透射仪、配有近摄镜的照相机，含黑白胶卷

暗房、冲片设备、显影、定影液、胶片和暗盒

有机玻璃同位素防护屏、盒、污物箱

2．试剂

高压消毒过的双蒸水

BSA （ 10mg/ml ）

α[32P]dCTP

大肠杆菌聚合酶K片段及其缓冲液

TE（pH 7）

10×MOPS

MOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）83.72 g

醋酸钠13.69 g

EDTA7.60 g

水1000 ml

pH调至7，水（加至）2000 ml

上样贮存液

甘油5 ml

EDTA0.1 g

溴酚蓝饱和液40 ul

水（加至）10 ml

存于4℃～-20℃

上样缓冲液

10×MOPS80 ul

上样贮存液80 ul

甲醛130 ul

甲酰胺360 ul

存于-20℃

1.4 %琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶1.4 g

10×MOPS10 ml

水85 ml

加热溶解，冷却至65 ℃，加入：

甲醛5 ml

溴乙锭饱和溶液5 ul

混匀后立即灌胶。

20×SSC

水800 ml

NaCl175.3 g

柠檬酸钠88.2 g

加数滴10mol NaOH溶液将pH值调至7.0

加水定容至1000 ml

分装后高压灭菌

10％SDS

水900 ml

SDS（十二烷基硫酸钠）100 g

加热68℃溶解，加数滴浓盐酸将值调节至7.2，

加水定容至1000 ml，分装

预杂交液

甲酰胺160 ml

20×SSC80 ml

2 mol Tris pH 81.4 ml

100×Denhardt's溶液3.2 ml

ssDNA （ 2mg/ml ）4 ml

葡聚糖（T70）40 g

水150 ml

37℃溶解，存于4℃

OLB液：

O液

1.25 mol Tris-HCl （ pH 8.0 ）

0.125 mol MgCl2

存于4℃

A液

O液1 ml

β－巯基乙醇18 ul

dA/T/GTP （各10mmol）溶于TE50 ul

存于-20℃

B液

2 mol HEPAS（pH 6.6）

（用4N NaOH调）

存于4℃

C液

随机引物（pd（N）6）溶于TE90 OD单位/ml

存于-20℃

OLB液（由以上A、B、C液配成）

A:B:C=100:250:150

存于-20℃

终止液

Tris-HCl,（pH 7.5）20 mmol

NaCl20 mmol

EDTA2 mmol

SDS0.25 ％（W/V）

dCTP1 umol

SephadexG50（中号）

3．实验材料

硝酸纤维素膜

实验17提取的总RNA

用作标记探针用的DNA

硅化玻璃纤维或小玻璃珠

碎冰及碎冰保温盛器

保鲜膜

三、实验步骤

1．RNA电泳

分别取每一样本10ug RNA旋转真空干燥，溶于24ul新配的上样缓冲液。置样品于65℃水浴中5分钟，迅速移入冰中冷却。移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去梳子。接通电源，负极靠近上样孔。依次吸取各样品20ul，按正常对照组、模型组次序，自左向右注入上样孔内。开启电源，电压调至150V，电泳约4小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。

轻轻取出凝胶，移至紫外透射仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺，拍照。

2．RNA转移至硝酸纤维素膜

取一洁净的容器，注入20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。取2-4层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于20×SSC中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置2-4层20×SSC浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。用4张保鲜膜沿凝胶外4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸的上方，铺4-6厘米厚的卫生纸，上置一平玻板，玻板上压一500克的重物。过夜。

次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在紫外投射仪上确认RNA已全部转移至硝酸纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。

3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行。）

水14 ul

OLB5 ul

BSA （ 10mg/ml ）1 ul

N-ras cDNA （100 ng ）2 ul

100℃×5min, 37℃×10min, 4℃×5min

α[32P]dCTP （50uCi）2.5 ul

大肠杆菌聚合酶K片段0.5 ul

混匀，4℃过夜，次日再加

大肠杆菌聚合酶K片段0.5 ul

半小时后加入终止液50 ul

4．离心柱分离探针

柱的制备：

取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头，堵住出口，将混匀的Sephadex G50（中号）移入吸头至满。取1.5ml Eppendorf管，剪去盖，放入10ml离心管中。将蓝吸头插入Eppendorf管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距1.5ml管底部约1-2厘米。1600×g离心4分钟，弃去1.5ml管中的TE液，再用100ul TE液加入小柱，离心，如此反复两次平衡柱子。

分离：

用镊子取出原1.5ml管，取一新的1.5ml管放入10ml离心管，插上平衡过的小柱。将标记的探针液，加入小柱，1600×g离心4分钟，小心取出1.5ml管，将分离的到的探针移入一标签过的1.5ml管，盖紧盖子。

5．探针变性

将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性，迅速移入冰中冷却。

6．杂交

将硝酸纤维素膜在2×SSC中浸湿，以防碎裂，然后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入10毫升预杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于42℃水浴摇床中摇晃预杂交1小时以上。取出袋，拭干，剪去一角，将变性了的探针加入，挤去气泡，封口。为防止含同位素的探针泄漏，外再封一杂交袋。置此袋于42℃水浴摇床中摇晃杂交过夜。

7．洗膜

取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入50ml管中，存于4℃冰箱，以备再用。剪去袋的四周，置此袋于2×SSC/0.1％SDS液中，取出膜，晃洗于此液。移膜入新的2×SSC/0.1％SDS液中，于45℃中晃洗半小时，如此重复一次。

8．曝光

取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒，放X光胶片于增感屏上，再放上膜，盖上盒，将片盒存于-70℃冰箱中。一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长曝光时间。

四、实验结果

X光胶片上可见两条杂交自显影带。杂交背景低。其中，肝癌模型组密度高，正常组密度低。表明，正常组仅有少量转录，而瘀毒阻滞证（DEN大鼠肝癌模型）肝脏（含肝癌）N-ras转录水平升高，提示这一改变是瘀毒阻滞证在基因转录水平上的特征。

五、注意事项

1．本方法采用放射性同位素标记，整个实验过程中务须严格遵守放射性同位素操作规则，注意安全。

2．本实验仅为实验教学而设，正式实验时，按小样本设计，每组大鼠起码要求10只以上。通常有两种方法可以采纳，一、分别每组各取一等量样本依次上样，电泳，转移。这样会得到10余张膜，杂交，扫描后，再作统计。二、鉴于试剂材料昂贵，可以把每一组内各肝脏取等量RNA混匀，再取各组等量RNA依次上样，电泳，扫描定量。这样可反映出组间的均数变化，但缺少离均差。

参考文献